人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC) 的培養(yǎng)方法

人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVEC) 是從臍帶靜脈中分離出來的原代細胞。這種細胞是研究內(nèi)皮細胞的模型系統(tǒng)，研究相關(guān)的低氧、炎癥、氧化應(yīng)激、感染反應(yīng)以及正常和腫瘤相關(guān)血管生成等應(yīng)用。TNF-α 和 IFN-γ 等細胞因子會誘導內(nèi)皮細胞激活（一種炎性反應(yīng)），并導致 VCAM-1/CD106 等細胞黏附分子上調(diào)，這些上調(diào)可使用熒光標記抗體和細胞成像進行定量，以下是人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）培養(yǎng)操作方法。

一、實驗方法原理

本實驗采用新鮮的健康產(chǎn)婦新生兒臍帶，采用膠原酶Ⅰ型用消化分離得到臍靜脈內(nèi)皮原代細胞。膠原酶是理想的血管內(nèi)皮細胞分離酶，對細胞間質(zhì)有較強的消化作用，能使上皮細胞與膠原組織成功分離，且不損傷內(nèi)皮細胞，分離出的血管內(nèi)皮細胞數(shù)量多，雜細胞污染少，且細胞貼壁能力強。

二、實驗材料    

1. 分離好的人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC

2. 試劑、試劑盒    

PBS膠原酶M199培養(yǎng)基胰酶EDTADMEM培養(yǎng)基

3. 儀器、耗材    

針頭手術(shù)鉗離心管低溫離心機彎管明膠恒溫培養(yǎng)箱顯微鏡

三、實驗步驟

1. 將 15-20cm 長的新生兒臍帶放入無菌的 PBS 溶液中儲存。（注：4℃下最多貯存 24 小時，室溫下不超過 6 小時，否則廢棄）

2. 用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌的 PBS 溶液沖洗 3-5 次，將污血沖洗干凈為止。

3. 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端，加入 15ml 的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化 15-20分鐘，并不時上下?lián)u動臍帶。

4. 消化完后，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入一個 50 ml 無菌離心管中，用無菌的 PBS 溶液沖洗臍帶 2-3 次。

5. 將收集液離心（2000 轉(zhuǎn)/ 分）3 分鐘。

6. 倒去上清，加入 10ml M199 培養(yǎng)基（加入 10U/ml 的 bFGF） ，用彎管吹散細 胞，將所有液體轉(zhuǎn)入一個用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。（注：每個培養(yǎng)瓶中加入 3- 4ml 無菌的 1%的明膠溶液，搖勻使得明膠溶液* 鋪滿瓶底，放入 37℃孵育，最少 2 小時，用前將明膠溶液倒了即可，明膠包被 有利于細胞貼壁。 ）

7. 培養(yǎng) 24 小時后，倒掉培養(yǎng)基，并用無菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次，洗掉紅細胞和死細胞，加入 10 ml 新鮮的 M199 培養(yǎng)基。

8. 以后每 2 天換一次培養(yǎng)基（每次換掉 2/3 的培養(yǎng)基） 。

9. 一般培養(yǎng) 5-7 天，細胞可長滿至 80-90%單層，這時可以傳代。

10. 倒掉培養(yǎng)基，用無菌的PBS 溶液清洗 2-3 次，加入2- 3ml 消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化細胞，在顯微鏡下觀察，一旦細胞變圓，即加入 2-3 倍的有血清的 DMEM 培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

11. 用彎管將細胞吹打下來，并將所消化的細胞轉(zhuǎn)移到一個 50 ml 無菌離心管中，2000 轉(zhuǎn)/ 分，離心 3 分鐘。

12. 倒掉上清，加入 10ml新鮮培基，一般一瓶細胞可傳代 3-4 瓶，以后照此傳代培養(yǎng)。

13. 一般傳代 2-3 代（培養(yǎng)了 20 天左右）用于做各種實驗效果較為好。

四、注意事項    

1. 嚴格進行消毒．使用三套器械取材。

2. 嚴格進行無菌操作，防止細菌、真菌、支原體污染，避免化學物質(zhì)污染。

3. 吸取液體前，瓶口和吸管進行火焰消毒；經(jīng)火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷卻。防止燙傷、燙死細胞。吸取液體時，避免瓶口和吸管接觸碰撞。

4. 離心管入臺前，管口、管壁應(yīng)消毒。