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蒂科生物2018春季血清* WB標準protocol
2018-03-21 瀏覽次數：1265
蒂科生物2018春季血清* WB標準protocol
蒂科生物2018春季血清*，成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：
1凝膠洗脫：轉移期間蛋白質必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質還截留在凝膠中，將無法在膜上進行分析
2吸附到膜上：在轉移過程中蛋白質必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進行分析
3處理期間仍截留在膜上：在轉移后的處理過程中蛋白質必須保持吸附在印跡膜上
4處理過程中可接近：被吸附的蛋白質必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質被掩蓋則無法檢測
蒂科生物2018春季血清*，成功進行WB檢測，則設置合適正確的對照是*的，只要正確設置了這些對照，即可快速和準確的找到WB的問題所在，并保證實驗結果的準確性和特異性！一般需要設置的對照如下：
l 陽性對照：明確表達檢測蛋白的組織或細胞，用于檢測抗體的工作效率
l 陰性對照：明確不表達檢測蛋白組織或細胞，用于檢測抗體的特異性
l 二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性
l 內參對照：檢測標本的質量和二抗系統
l 空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質和封閉的效果
蒂科生物2018春季血清*，WB檢測基本過程
1、獲取細胞或組織裂解物
1)根據檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：
蛋白位置 | 推薦buffer |
全細胞 | NP-40 or RIPA |
胞漿（可溶性蛋白） | Tris-HCl |
胞漿（骨架結合蛋白） | Tris-Triton |
膜蛋白 | NP-40 or RIPA |
核蛋白 | RIPA or 核蛋白提取試劑盒 |
線粒體蛋白 | RIPA or 線粒體分離試劑盒 |
亦可購買商業化的蛋白提取試劑盒來保證標本制備的質量
2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準確性！
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay,Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據情況將標本保存在-20°C /-80°C備用，進行免疫沉淀（IP）或者直接進行電泳分離蛋白
3、電泳分離蛋白質
蒂科生物2018春季血清*，根據待測蛋白狀態確定電泳條件：
待測蛋白狀態 | 凝膠條件 | 上樣buffer | 電泳buffer |
Reduced - Denatured | 還原，變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
Reduced - Native | 還原，不變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
Oxidized - Denatured | 不還原，變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
Oxidized - Native | 不還原，不變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
根據待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度
蛋白分子量（kDa） | 凝膠濃度（％） |
4-40 | 20 |
12-45 | 15 |
10-70 | 12.5 |
15-100 | 10 |
25-200 | 8 |
4、轉膜
根據不同的檢測目的和待測蛋白的特性，選擇合適的膜類型。常用的轉移膜類型有：PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術參數及比較如下：
| PVDF膜 | NC膜 | 尼龍膜 |
靈敏度和分辨率 | 高 | 高 | 高 |
背景 | 低 | 低 | 較高 |
蛋白結合能力 | 100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結合） | 80-100ug/cm2 | >400ug/cm2 |
機械強度 | 強 | 干的膜易脆 | 軟而結實 |
溶劑抗性 | 強 | 差 | 差 |
使用前是否需要浸潤 | 100%甲醛潤濕 | 緩沖液潤濕 | 緩沖液潤濕 |
適用染色方法 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁 | 不能用陰離子染料 |
適用檢測方法 | 顯色法、化學發光、熒光、放射性、化學熒光、快速免疫檢測 | 顯色法、化學發光、熒光、放射性 | 顯色、化學發光、放射性 |
適用范圍 | 普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質測序、氨基酸分析、重復檢測 | 普通蛋白WB、氨基酸分析、重復檢測。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白 | 低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用 |
價格 | 高 | 較低 | 低 |
5、封閉
去掉膜上多余的非特異性結合位點，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
6、一抗孵育
一抗的選擇成功與否，是整個WB實驗成功的關鍵：選擇一抗有以下幾個注意點：
l 選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）
l 選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）
l 選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體
一抗的保存和使用：
l 根據說明書的要求條件進行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復凍融。
l 抗體的工作液現配現用，在4度保存不要超過2周
l 根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異，說明書推薦的稀釋比例只作參考，需要在說明書推薦的濃度周邊進行多個濃度梯度的實驗檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進行實驗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索*稀釋度（1:100-1:3000）。
l 孵育條件：推薦4°C孵育過夜（一般大于18個小時），根據抗體親和力不同孵育時間有所區別
7、二抗孵育
根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索*稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時
8、底物孵育
選擇顯色或者化學發光底物。一般傾向于化學發光，靈敏度高且背景低，節省抗體用量
9、結果分析和檢測
凝膠成像系統檢測或者暗室曝光到膠片
Note：從封閉開始，每步之間都需要用TBST進行洗滌，3次，每次5min
蒂科生物2018春季血清*，WB技術要點和常見問題分析
WB過程中常見的問題及可能原因分析
問題 | 可能原因 | 驗證或解決辦法 |
轉膜不充分 | 膜沒有*均勻濕透 | 使用100% methanol浸透膜 |
靶蛋白分子量小于10,000 | 選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間 | |
靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液pH值 | 可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液 | |
甲醇濃度過高 | 過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替 | |
轉移時間不夠Thick gel | 對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間 | |
背景高 | 膜沒有*均勻濕透 | 使用100% methanol浸透膜 |
洗膜不充分 | 增加洗液體積和洗滌次數 | |
阻斷不充分 | 增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等） | |
二抗濃度過高 | 降低二抗濃度 | |
檢測過程中膜干燥 | 保證充分的反應液，避免出現干膜現象 | |
曝光過度 | 縮短曝光時間 | |
抗體與阻斷蛋白有交叉反應 | 檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應 | |
沒有陽性條帶 | 抗體染色不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
酶失活 | 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物 | |
標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。 | |
試劑不匹配 | 一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性 | |
一抗失效 | 選擇在有效期內抗體；并選擇現配現用的工作液 | |
HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊N化Na | |
有陽性條帶，但條帶比較弱 | 抗體染色不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
酶活性降低 | 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物 | |
標本中靶蛋白含量太低 | 增加標本上樣量。 | |
洗膜過度 | 縮短洗滌時間 | |
HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊N化Na | |
抗體活性降低 | 選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置 | |
蛋白轉移不充分 | 見上述 | |
封閉過度 | 減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑類型 | |
曝光時間過短 | 延長曝光時間 | |
HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊N化Na | |
條帶位置（大小）不對；或有非特異性條帶 | 二抗的非特異性結合 | 增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的） |
一抗的特異性不夠 | 使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性 | |
蛋白降解 | 使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑 | |
二聚體或多聚體存在 | 增加蛋白質變性過程及強度 | |
抗體濃度過高 | 降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶 | |
蛋白上樣量過大 | 降低上樣量 | |
背景有斑點 | 封閉劑中有聚集體 | 使用前過濾封閉試劑 |
HRP耦聯二抗中有聚集體 | 過濾二抗試劑，去除聚集體 | |
膜上出現反像（暗背景上白色帶） | HRP含量過高 | 降低酶聯二抗的濃度 |
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